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蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法

來(lái)源: http://www.dsddy.cn/  類(lèi)別:實(shí)用技術(shù)  更新時(shí)間:2010-10-29  閱讀
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蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法一般來(lái)說(shuō),有以下五種:凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。

五種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較

方法

靈敏度

時(shí)間

原理

干擾物質(zhì)

說(shuō)明

凱氏定氮法

(Kjedahl法)

靈敏度低,適用于0.2~ 1.0mg氮,誤差為 ±2%

費(fèi)時(shí)

8~10小時(shí)

將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨,用酸吸收后滴定

非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離)

用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定;干擾少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)

雙縮脲法(Biuret法)

靈敏度低

1~20mg

中速

20~30分鐘

多肽鍵+堿性Cu2®紫色絡(luò)合物

硫酸銨;

Tris緩沖液;

某些氨基酸

用于快速測(cè)定,但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似

紫外吸收法

較為靈敏

50~100mg

快速

5~10分鐘

蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收

各種嘌吟和嘧啶;

各種核苷酸

用于層析柱流出液的檢測(cè);核酸的吸收可以校正

Folin-酚試劑法(Lowry法)

靈敏度高

~5mg

慢速

40~60

分鐘

雙縮脲反應(yīng);磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原

硫酸銨;

Tris緩沖液;

甘氨酸;

各種硫醇

耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí);

顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)

靈敏度最高

1~5mg

快速

5~15分鐘

考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其lmax由465nm變?yōu)?95nm

強(qiáng)堿性緩沖液;

TritonX-100;

SDS

最好的方法;

干擾物質(zhì)少;

顏色穩(wěn)定;

顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

     從以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),如紫外吸收法測(cè)定時(shí)間快。但是綜合起來(lái),最后一種考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)效率最高,無(wú)論是測(cè)定時(shí)間,靈敏度還是受干擾程度,都是比較占優(yōu)勢(shì)的。

    下面,我們來(lái)重點(diǎn)介紹一下其中一種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法--凱氏定氮法。

凱氏定氮法(Kjedahl法)

首先將濃硫酸倒入樣品中,邊倒邊搖晃,以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸,然后加熱試劑。如果你需要加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度,可以加入CuSO4作催化劑,這樣,實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間就會(huì)大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應(yīng)生成氨氣,然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用,固定了氮元素。這時(shí)我們得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應(yīng),通過(guò)計(jì)算NaOH的使用量,就可以計(jì)算出氮的含量。下面是整個(gè)定氮法中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。

    CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3    (1)

    2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4                       (2)

    (NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3        (3)

       當(dāng)我們得到氮的含量以后,我們就可以通過(guò)一定的計(jì)算,最終算出蛋白質(zhì)的含量。

       凱氏定氮法常用于有機(jī)化合物中的氮含量的測(cè)定,是蛋白質(zhì)含量測(cè)定的經(jīng)典方法,雖然在測(cè)試過(guò)程中,試劑用量很大,但是,不可否認(rèn),它所適用的樣品范圍之廣,測(cè)試結(jié)果之精確,都是公認(rèn)的。

       現(xiàn)在,隨著科技的發(fā)展,我們已經(jīng)研究出帶消化爐的凱氏定氮儀,它把定氮過(guò)程中的前兩步驟通過(guò)儀器完成,方便了整個(gè)過(guò)程的實(shí)施。凱氏定氮儀能夠自動(dòng)的對(duì)樣品進(jìn)行消化,然后蒸餾,智能化完成,節(jié)省了時(shí)間和精力,提高了工作效率。這種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法具有有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。浙江托普儀器有限公司提供這種產(chǎn)品,24小時(shí)服務(wù)熱線:0571-87515059
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