蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法
蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法一般來(lái)說(shuō),有以下五種:凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。
表 五種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較
方法 |
靈敏度 |
時(shí)間 |
原理 |
干擾物質(zhì) |
說(shuō)明 |
凱氏定氮法 (Kjedahl法) |
靈敏度低,適用于0.2~ 1.0mg氮,誤差為 ±2% |
費(fèi)時(shí) 8~10小時(shí) |
將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨,用酸吸收后滴定 |
非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離) |
用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定;干擾少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng) |
雙縮脲法(Biuret法) |
靈敏度低 1~20mg |
中速 20~30分鐘 |
多肽鍵+堿性Cu2+®紫色絡(luò)合物 |
硫酸銨; Tris緩沖液; 某些氨基酸 |
用于快速測(cè)定,但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似 |
紫外吸收法 |
較為靈敏 50~100mg |
快速 5~10分鐘 |
蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 |
各種嘌吟和嘧啶; 各種核苷酸 |
用于層析柱流出液的檢測(cè);核酸的吸收可以校正 |
Folin-酚試劑法(Lowry法) |
靈敏度高 ~5mg |
慢速 40~60 分鐘 |
雙縮脲反應(yīng);磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 |
硫酸銨; Tris緩沖液; 甘氨酸; 各種硫醇 |
耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí); 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法) |
靈敏度最高 1~5mg |
快速 5~15分鐘 |
考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其lmax由465nm變?yōu)?95nm |
強(qiáng)堿性緩沖液; TritonX-100; SDS |
最好的方法; 干擾物質(zhì)少; 顏色穩(wěn)定; 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
從以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),如紫外吸收法測(cè)定時(shí)間快。但是綜合起來(lái),最后一種考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)效率最高,無(wú)論是測(cè)定時(shí)間,靈敏度還是受干擾程度,都是比較占優(yōu)勢(shì)的。
下面,我們來(lái)重點(diǎn)介紹一下其中一種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法--凱氏定氮法。
凱氏定氮法(Kjedahl法)
首先將濃硫酸倒入樣品中,邊倒邊搖晃,以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸,然后加熱試劑。如果你需要加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度,可以加入CuSO4作催化劑,這樣,實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間就會(huì)大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應(yīng)生成氨氣,然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用,固定了氮元素。這時(shí)我們得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應(yīng),通過(guò)計(jì)算NaOH的使用量,就可以計(jì)算出氮的含量。下面是整個(gè)定氮法中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
當(dāng)我們得到氮的含量以后,我們就可以通過(guò)一定的計(jì)算,最終算出蛋白質(zhì)的含量。
凱氏定氮法常用于有機(jī)化合物中的氮含量的測(cè)定,是蛋白質(zhì)含量測(cè)定的經(jīng)典方法,雖然在測(cè)試過(guò)程中,試劑用量很大,但是,不可否認(rèn),它所適用的樣品范圍之廣,測(cè)試結(jié)果之精確,都是公認(rèn)的。