酶抑制率法（分光光度法）
在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
10.1 pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
10.2 顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4° C冰箱中保存。
10.3 底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆�。保存期不超過兩周。
10.4 乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3 min的吸光度變化D A0值應(yīng)控制在0. 3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆�，保存期不超過四天。
10.5 可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的D A0值應(yīng)控制在0. 3以上。
11 儀器
11.1 分光光度計或相應(yīng)測定儀及常量天平。
12 分析步驟
12.1 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1~2min，倒出提取液，靜置3~5min，待用。
12.2 對照溶液測試： 先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37° C放置15min以上（每批樣品的控制時間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值DA0。
12.3 樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DAt。
13 結(jié)果的表述計算
13.1 結(jié)果計算
檢測結(jié)果按公式計算：抑制率(%)=[ (DA0-DAt)/ DA0]×100
式中：DA0 棗對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值； DAt 棗樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；
13.2 結(jié)果判定
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時，表示蔬菜中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
14 附則
14.1酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)
14.1.1 靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限見表2酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限
農(nóng)藥名稱 檢出限mg/kg 農(nóng)藥名稱 檢出限mg/kg
敵敵畏 0.1 氧化樂果 0.8
對硫磷 1.0 甲基異柳磷 5.0
辛硫磷 0.3 滅多威 0.1
甲胺磷 2.0 丁硫克百威 0.05
馬拉硫磷 4.0 敵百蟲 0.2
樂果 3.0 呋南丹 0.05
14.1.2 符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
15 說明
15.1 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
15.2 當(dāng)溫度條件低于37° C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3min的吸光度變化D A0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時間應(yīng)與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3min的吸光度變化D A0值＜0.3 的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。
15.3 當(dāng)吸光度大到無法讀取時，說明測定液渾濁有干擾。
16 方法注釋
16.1 兩種方法的共同點：以上兩種方法的原理、緩沖（提�。┤芤簆H值、測定中的干擾物質(zhì)和排除方法基本相同。
16.2 速測卡法的檢出限：方法文本中的表1，是由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、廣東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、香港政府化驗所、廣東省農(nóng)藥檢定所、深圳市衛(wèi)生防疫站、華南農(nóng)大昆蟲毒理研究室七個單位，使用速測卡法，對我國常見使用的一些有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢出限的實驗與驗證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計表。從表1可以看出，在使用速測卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽性時，即可視為有機磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥已超標(biāo)。在有條件的單位，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對陽性試樣進行進一步的實驗來確定是哪種農(nóng)藥、確切含量。
16.3 酶抑制率法的選擇：在氣相色譜分析儀還未問世及分布較少時，對有機磷類農(nóng)藥的檢測即采取了酶抑制分光光度法，只是由于當(dāng)時酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長。由于這兩個現(xiàn)實情況，在實驗前，必需測試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進行。
16.4 速測卡法操作簡單、使用方便，常溫下試藥的有效期可達(dá)一年。酶抑制率光度法與速測卡法比較操作要煩瑣些，夏天時，試藥需要冷藏運輸，但以數(shù)字形式讀取數(shù)據(jù)，較為直觀。中國糧油儀器網(wǎng) http://m.pfyin.com
