利用葉綠素測量儀研究桑葉的葉綠素含量
葉綠素是植物吸收光能進行光合作用的重要物質基礎,它直接參與光能的吸收、傳遞、分配和轉化等過程,其含量的大小以及a/b的相對比值不僅可以反映植物的生長發(fā)育狀況、生理代謝水平及營養(yǎng)條件,還可作為環(huán)境生理研究的重要參考指標[1]。因此,對其含量及a/b比值進行測定與分析一直是植物生理學研究的重點內容。
葉綠素是脂溶性卟啉類化合物,在分子結構上,葉綠素由脫鎂卟啉環(huán)、葉綠酸、葉綠醇、甲醇和二價鎂離子等部分構成,各葉綠素結構之間的差別很小,葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團不同:前者是甲基,后者是甲醛基;在光學特性上,葉綠素a和b及其衍生物對紅光區(qū)(620~700 nm)和藍紫光區(qū)(400~500 nm)的光吸收特別強烈;而對綠光區(qū)(520~580 nm)的光則吸收較弱,因而葉綠素呈現(xiàn)綠色。
目前,葉綠素的提取方法主要有有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、吸附樹脂萃取法、超聲波萃取法和微波萃取法等。其中微波輔助萃取法和超臨界CO2萃取法由于能夠大大降低提取時間,并減少萃取溶劑的使用量,逐漸受到人們的關注,但超臨界CO2萃取法受操作復雜、設備昂貴、成本較高等因素的困擾,其應用領域也受到限制。有機溶劑萃取法有直接利用葉綠素易溶于有機溶劑的特點,選用合適的有機溶劑進行萃取,并輔助了微波、超聲波或離子交換分離等手段來提高效率和純度。因此,有機溶劑萃取法是最常用的葉綠素提取的常規(guī)方法。葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、葉綠素測量儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法等,其中分光光度法具有準確度高的特點,是葉綠素含量測定過程中應用最為廣泛的方法。
筆者擬采用有機溶劑萃取法從桑葉中提取葉綠素,并利用分光光度法對葉綠素含量進行測定,通過分析不同節(jié)位桑葉及桑葉不同部位的葉綠素含量,探討桑葉葉綠素的光譜特征及其含量的變化規(guī)律,以期為桑葉葉綠素的提取及含量測定提供方法性參考,并為桑葉葉綠素的進一步研究提供參考數(shù)據(jù)。
1材料與方法:
1.1材料
1.1.1試驗材料:桑葉,采自中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所國家種質鎮(zhèn)江桑樹圃。
1.1.2主要試劑:試驗所用試劑均為分析純。
1.1.3主要儀器:UV-9100型紫外-可見分光光度計,由浙江托普分析儀器有限公司生產;電熱恒溫水浴鍋,由杭州麥哲儀器設備廠生產;YP5001型電子天平,由浙江托普儀器廠生產;打孔器(d=0. 6 cm)。
1.2方法:
1.2.1葉綠素的提取含量測定方法。將采集到的新鮮桑葉帶回實驗室洗凈、擦干后,用直徑為0.6 cm的打孔器打成小圓片;選取5片稱重,然后用6ml有機溶劑在暗室浸提24 h;于5 000 r/min離心機中離心5min,取上清液置于光徑為1.0 cm的比色皿中,用紫外-可見分光光度計測定其吸光值,并利用Arnon法的修正公式對其葉綠素含量進行計算,分析桑葉葉綠素的光譜特征,進而比較研究不同節(jié)位桑葉和桑葉不同部位葉綠素含量的變化規(guī)律,綠素含量用Arnon法的修正公式進行計算:
其中,V為萃取溶劑體積(ml);S為表面積(cm2),通過樣品個數(shù)(5片)與打孔器面積(d=0.6 cm)之積進行計算;Ca為葉綠素a含量,Cb為葉綠素b含量,Ca+b為葉綠素a和b的含量之和;A645、A663分別代表在波長為645 nm和663 nm下的吸光度值,所有試驗均重復3次。
1.2.2 桑葉葉綠素光譜特征分析。用紫外-可見分光光度計在360~700 nm的波長范圍內,測定不同波長條件下,桑葉葉綠素的吸光度值,繪制桑葉葉綠素的光譜圖。
2結果與分析:
2.1桑葉葉綠素的光譜特征:
通過測定不同波長條件下桑葉葉綠素的含量,繪制出其光譜圖(圖1),由圖1可知:在試驗范圍內,桑葉葉綠素有2個強吸收帶,分別為400~460 nm和640~680 nm,其中400~460 nm為藍紫光區(qū),吸收最高峰出現(xiàn)在432 nm處,而640~680 nm是紅光區(qū),且在662 nm處出現(xiàn)最高吸收峰,這是由于葉綠素中的葉綠素a和葉綠素b分別在這2個波長處吸收最強,所得結果與其他高等植物葉片中葉綠素的吸收光譜圖基本一致。
2.2不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量測定結果:
因所受光照強度不同、老嫩程度不一,不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量也會有所不同。該研究采集第2、12和22節(jié)的桑葉(從底部到頂端依次排序),用有機溶劑萃取法和分光光度法測定不同節(jié)位桑葉的葉綠素含量,并分析其變化規(guī)律,結果如圖2所示。由圖2可知,第12節(jié)桑葉中葉綠素含量最高,但葉綠素a/b的比值最低,為1.55;第2節(jié)桑葉中葉綠素含量稍低,葉綠素a/b比值為2.54;而第22節(jié)桑葉中葉綠素含量最少,但葉綠素a/b比值為2.46,與第2節(jié)桑葉的葉綠素a/b比值幾乎相等。
一般來說,上部葉片最嫩,中部次之,下部最老,且植物的氮素營養(yǎng)是從成熟葉片向幼嫩葉片轉運,葉綠素含量成熟葉應多于幼嫩葉。根據(jù)此理論,下部葉片中葉綠素含量應最高,這與該研究結果有差異,之所以會出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象,一方面可能是由于葉片所受光照強度不同引起的。中部葉片所受光照較下部葉片強烈,且從葉綠素a/b的比值也可以看出,中部葉片的葉綠素a/b最低,即葉綠素b的含量最高,說明桑樹中部葉片最耐陰,較低的光強即可刺激葉片進行強烈的光合作用,這也是桑樹進行光合作用的主要來源。上部葉片最嫩,雖然接受光強最強,但由于植物本身的生理特征決定了上部葉片的葉綠素含量最低。另一方面可能是由試驗誤差引起的差異。從試驗結果可知,中部葉片葉綠素含量的測定結果的誤差最大,引起該誤差的因素有很多,這也是造成結果不一的1個因素。
2.3 桑葉不同部位的葉綠素含量測定結果:
一片桑葉因不同的光照強度、營養(yǎng)狀況及生理條件間的細微差別,會導致桑葉不同部位中葉綠素含量也有差異。該研究將桑葉分為3部分,即葉尖、葉中和葉柄,分別測定不同部位的葉綠素含量,結果如圖3所示。
由圖3可知,靠近葉柄處葉綠素含量明顯高于其他部位,葉綠素含量高低順序為葉柄處(葉中部(葉尖部,呈現(xiàn)出下部葉位大于上部葉位的規(guī)律。這可能是因為植物的氮素營養(yǎng)是從成熟葉片向幼嫩葉片轉運,葉綠素含量成熟葉多于幼嫩葉,使桑樹葉片葉色隨之發(fā)生相應變化而導致吸光值的不同。此外,葉尖部的葉綠素a/b比值最低,葉柄處的最高,葉中部其次,說明桑葉葉尖部最耐陰,葉綠素b含量較高,可適應陰生生境,而葉柄部相對最不耐陰。
3結論與討論:
對葉綠素進行準確測定是植物生理學的重點研究內容,葉綠素a和b含量的多少直接影響光合速率的大小,葉綠素a/b值也能反映一定的光合速率, a/b值高,光合活性也高,光合活性高,植物就具有較高的光合速率。試驗結果表明:
①桑葉葉綠素光譜特征與其他高等植物葉綠素的光譜特征類似,可采用Arnon法的修正公式對葉綠素含量進行計算。
②中間節(jié)位的桑葉中葉綠素含量最高,但其葉綠素a/b的比值卻最小,雖然該結果存在一定爭議,但從葉綠素含量來看,桑樹光合作用的葉綠素主要來源是中部節(jié)位的葉片。
③對同一片葉子而言,因光照強度、營養(yǎng)狀況和生理條件的不同,不同部位葉片的葉綠素含量會有所不同,該研究結果證實了這一點。研究發(fā)現(xiàn),葉柄處的葉綠素含量最高, a/b值也最高,說明在葉柄處的光合速率最高,且由于葉綠素b的含量較低,說明葉柄處較適應陽性生境,而葉尖處與其正好相反。
試驗僅對桑葉中葉綠素的光譜特征及其含量的變化規(guī)律進行了初步探討,該結果為葉綠素的進一步研究提供了必要的參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。