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幾種蛋白質(zhì)含量測(cè)量方法比較

來源: 本站  類別:實(shí)用技術(shù)  更新時(shí)間:2010-08-31  閱讀
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幾種蛋白質(zhì)含量測(cè)量方法比較
蛋白質(zhì)含量測(cè)定一直是生物化學(xué)中最常用、最基本的分析方法之一。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。機(jī)體每個(gè)系統(tǒng)都有蛋白質(zhì)的參與,蛋白質(zhì)占人體重量的16.3%。人體的蛋白質(zhì)主要來源于食物:豆制品、肉類或者奶粉等副食品。既然蛋白質(zhì)都來自于食物,那么測(cè)定食物中的蛋白質(zhì)含量就變得很有必要。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定有好多種方法,歸納起來為:凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法。不同的方法,原理、步驟和實(shí)驗(yàn)試劑都各不相同,但是一直以來,凱氏定氮法最為經(jīng)典,使用最為廣泛。近幾年,根據(jù)蛋白質(zhì)測(cè)定的凱氏定氮法,很多廠家已研制出了相應(yīng)的儀器,如:蛋白質(zhì)測(cè)定儀。蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)出的蛋白質(zhì)含量,包括其他非蛋白含氮化合物,如游離氨基酸、尿素等物質(zhì),因此該儀器有時(shí)又被叫做粗蛋白測(cè)定儀。
下面我們列表來對(duì)各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法進(jìn)行比較。
方法
靈敏度
時(shí)間
原理
干擾物質(zhì)
說明
凱氏定氮法
靈敏度低,使用于0.2-1.0mg氮,誤差為±2%
費(fèi)時(shí),8-10小時(shí),但如果采用凱氏定氮儀,縮短時(shí)間至4個(gè)小時(shí)
將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨氣,然后用酸吸收滴定
非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離)
用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定,干擾少,如果采用凱氏定氮儀,就會(huì)大大縮短定氮時(shí)間
雙縮尿法
靈敏度低,1-20mg
中速20-30分鐘
多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡(luò)合物
硫酸銨:Tris緩沖液,某些氨基酸
用于快速測(cè)定,但不靈敏,不同蛋白質(zhì)顯色相似
Folin酚試劑法
靈敏度高,<5微克
慢速40-60分鐘
雙縮尿反應(yīng),磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原
硫酸銨,Tris緩沖液,甘氨酸,各種硫醇
耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng);操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí);顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
紫外吸收法
較為靈敏,50-100微克
快速5-10分鐘
蛋白質(zhì)中的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基在280nm處德 光吸收
各種嘌呤和各種核苷酸
用于層析柱流出液的檢測(cè),核酸的吸收可以校正
考馬斯亮藍(lán)法
靈敏度最高,1-5微克
快速5-15分鐘
考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),其λmax由465nm變?yōu)?95nm
強(qiáng)堿性緩沖液,TritonX-100SDS
最好的方法,干擾物質(zhì)少,顏色穩(wěn)定,顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
由上表可知,考馬斯亮藍(lán)法和Folin酚試劑法靈敏度最高,比紫外吸收方法高10-20倍。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜,但是精確度較高,因此作物蛋白質(zhì)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法,而蛋白質(zhì)測(cè)定儀的發(fā)明,更是推動(dòng)了凱氏定氮法的發(fā)展。我們?cè)谶x擇何種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí),應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況,從下面幾個(gè)點(diǎn)考慮:1.實(shí)驗(yàn)堆測(cè)定所要求的靈敏度和精確度。2.蛋白質(zhì)的性質(zhì)3.溶液中存在的干擾物4.測(cè)定時(shí)間。從以上四個(gè)方面綜合考慮,最后選擇最合適的測(cè)定方法。
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