大豆蛋白的提取與含量測定
大豆蛋白的提取與含量測定
大豆（學(xué)名：Glycine max），中國古稱菽，是一種其種子含有豐富的蛋白質(zhì)的豆科植物。大豆呈橢圓形、球形，顏色有黃色、淡綠色、黑色等，故又有黃豆、青豆、黑豆之稱。蛋白質(zhì)分子是含有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離度相等，成為帶有正負(fù)電荷相等的兩性離子，在電場中不向兩極移動，并且極易沉淀。氨基酸組成不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。根據(jù)在一定條件下（如PH，離子強(qiáng)度等）它們所帶電荷的數(shù)量和種類，分子的大小及形狀等方面的差異，可以采用電泳，離子交換柱層析等方法對它們進(jìn)行分離分析。
試劑和器材
1、試劑
（1）10%Nacl （2）0.2%NaoH
（3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL
（5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH
2、器材
（1）離心機(jī) （2）燒杯 （3）滴管
（4）PH試紙（5）自動型凱氏定氮儀等
操作方法
1、水抽提
將豆粉5g用約40毫升左右的蒸餾水少量多次的添加攪拌，常溫下攪拌抽提15min， 3800r/min離心15min，取上清液，如上清液不清澈再經(jīng)過濾。
取上清液1毫升稀釋50倍留做蛋白測定。
其余清液加入等體積在冰箱中預(yù)冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（攪拌）6mol/L和1 mol/L HCL，調(diào)PH4.5~5.0，3800r/min，離心15min，收集沉淀物，反復(fù)用丙酮攪拌洗滌離心2次，得到粉末狀蛋白質(zhì)干粉，稱重，計算粗產(chǎn)率。
Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量
目的要求
掌握Folin酚法測定蛋白濃度的原理和方法
蛋白質(zhì)濃度可以從它們的物理化學(xué)性質(zhì)，如比重、紫外吸收，折射率等測定而得知；或用化學(xué)方法，如定氮、雙縮脲反應(yīng)，F(xiàn)olin酚試劑反應(yīng)等方法來計算。也可以用染色法，如氨基黑，考馬斯亮藍(lán)法測定。還可以用熒光激發(fā)法，氰胺 ，放射性同位素計數(shù)等靈敏度較高的方法。在這些方法中，其中雙縮脲法和Folin酚法是一般實(shí)驗(yàn)室中常用的方法，它們操作簡便，迅速，不需要復(fù)雜而昂貴的儀器。Folin酚法靈敏度高，比雙縮脲法靈敏100倍。
原理
Folin酚法是所用試劑是由兩部分組成，試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑，蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下可與銅離子起顯色反應(yīng)。試劑乙中的磷鉬酸和磷鎢酸在堿性條件下不穩(wěn)定，易被酚類還原而呈蘭色（鉬蘭和鎢蘭混合物）。
由于蛋白質(zhì)中含有帶酚基的酪氨酸還原呈蘭色，溶液蘭色的深淺與蛋白濃度有較好的線性關(guān)系。因此用Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量，靈敏度較高。
樣品中含酚類化合物及檸檬酸均有干擾作用，如果樣品酸度較高則顯色較淺，要提高碳酸鈉一氫氧化鈉的濃度。此法也可測定溶液中酪氨酸和色氨酸的濃度。
Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一個，只是在各溶液的濃度及填加量上，保溫的溫度及保溫時間上有所不同而已，本實(shí)驗(yàn)所介紹的是本室常用的，靈敏度較高的操作方法。
試劑和器材
1、材料：
本實(shí)驗(yàn)所提取大豆蛋白水提取液，經(jīng)合適稀釋至可測定范圍。
2、試劑：
（1）0.03mol/L PH7.8的磷酸緩沖液。
（2）200μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)酪（牛血清）蛋白溶液。
（3）Folin試劑甲：（俗稱堿性銅試劑）：10g
NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；
稱取0.5g酒石酸鉀鈉溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上兩溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一個月。
4、Folin試劑乙：在2升磨口回流裝置的燒瓶內(nèi)，加鎢酸鈉（NaWO4•2H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO•2M2O）25g，蒸餾水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，充分混合后，小火回流10小時，再加硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml及數(shù)滴溴。然后開口沸騰15min，以驅(qū)除過量的溴，冷卻后定容到1000ml，過濾后呈金黃色，于棕色并中保存，可使用多年。
蛋白質(zhì)的測量可以使用儀器直接來進(jìn)行測量，可以使用全自動定氮儀，它主要用來檢測糧食、食品、乳制品、飲料、飼料、土壤、水、藥物、沉淀物和化學(xué)品等中的氨氮、蛋白質(zhì)氮等含量。檢測方法符合國標(biāo)、 AOAC、ISO等。
