蛋白酶和淀粉酶活性檢測(cè)方法探討
隨著酶制劑在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用日益增多，產(chǎn)品質(zhì)量也參差不齊，市場(chǎng)上時(shí)有低劣酶制劑出現(xiàn)，而酶制劑酶活的測(cè)定比較繁瑣，有關(guān)酶活的定義、測(cè)定方法、測(cè)定條件尚不統(tǒng)一，給廣大用戶在選購(gòu)和使用時(shí)造成很多不便，難免上當(dāng)受騙造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。本文就蛋白酶(中性蛋白酶和酸性蛋白酶)和淀粉酶活力簡(jiǎn)便、快速測(cè)定方法簡(jiǎn)介如下:
1蛋白酶活力的測(cè)定
1.1原理
采用福林-酚試劑法。福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類(lèi)化合物還原呈藍(lán)色(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物)，由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)。因此可利用此原理測(cè)定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時(shí)間后終止酶促反應(yīng)，經(jīng)離心或過(guò)濾除去酪蛋白籌沉淀物后取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色，藍(lán)色的深淺與濾液中生成產(chǎn)物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定，從而計(jì)算出蛋白酶的活力。
1.2試劑
1.2.l福林-酚試劑
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉及700mL的去離子水，再加入50mL85%的磷酸及濃鹽酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，結(jié)束后再加入150g的硫酸鋰(LiSO4)、50mL去離子水及數(shù)滴溴水，再繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后濾液呈黃綠色(如仍呈綠色，需再重復(fù)滴加溴水的步驟)，加去離子水定容至1000mL亂，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中，貯于冰箱中可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆�。此溶液使用時(shí)可按1:3比例用去離子水稀釋。
1.2.20.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精確稱取TCA65.4g，加去離子水定容至1000mL。
1.2.30.4mo1/L碳酸鈉溶液精確稱取無(wú)水碳酸鈉42.4g，加去離于水溶解后，定容至1000mL。
1.2.4pH值3～6醋酸緩沖液
精確取NaAc?3H2O16g與268mL濃度為6mol/L醋酸溶液混合，用去離子水稀釋定容至1000mL。
1.2.52%酪蛋白底物緩沖液
1.2.5.1測(cè)試酸性蛋白酶緩沖液
精確稱取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氫氧化鈉20mL(用去離子水配制)，在水浴中加熱溶解，然后用pH值3.6醋酸緩沖液定容至1000mL。當(dāng)日配用或置于冰箱中保存。
1.2.5.2測(cè)試中性蛋白酶緩沖液精確稱取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/LNa2HPO4溶液(去離子水配制)610mL，在沸水浴中攪拌使其溶解，冷卻后過(guò)濾，加入0.2mol/LNa2HPO4溶液(去離子水配制)390mL，用去離子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。當(dāng)天配用或置于冰箱中保存。
1.2.6100μg/mL酪氨酸溶液
精確稱取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L鹽酸溶解后，用去離于水定容至100mL放入冰箱中保存，臨用時(shí)用去離子水稀釋10倍。
1.3操作步驟
1.3.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取18支試管分成6組(每組3支，平行樣)，編號(hào)，按表1分別加入標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸、去離子水、0.4mol/L的碳酸鈉和福林-酚試劑，混勻后，放入40℃水浴保溫20min，然后在721型分光光度計(jì)上進(jìn)行比色創(chuàng)定(波長(zhǎng)66Onm)，以濃度為Oμg/mL酪氨酸反位液做空白對(duì)照。
1.3.2樣品酶活的測(cè)定
精確稱取酶粉5g，充分碾細(xì),加去離子水100mL，在40℃水浴中攪拌30min，充分溶出酶蛋白，然后過(guò)濾，留濾液待測(cè)。取4支試管編號(hào)(1號(hào)為空白對(duì)照)，分別加入酶液1mL,1號(hào)管立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，使酶失活，另3支樣品加入lmLpH7.0、濃度為2%酪蛋白底物緩沖液(如測(cè)酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物緩沖液)，迅速混勻，并立即放入40℃恒溫水浴準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，保溫1Omin后，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，終止反應(yīng)，同時(shí)向1號(hào)空白管中加入1mL2%酪蛋白底物緩沖液，搖勻，繼續(xù)置于水浴中保溫2Omin，取出離心或過(guò)濾除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各試管濾液1mL，分別移入另4支試管中，再加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5nL和己稀釋的福林-酚試劑1mL，搖勻，保溫顯色20min后，進(jìn)行比色測(cè)定(波長(zhǎng)66Onm)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酪氨酸含量。
管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸去離子水Na2CO3福林一酚試劑酪氨酸含量
(100μg/mL)(mL)(mL)(0.4mol/L)(mL)(mL)(μg/mL)
101.0510
20.20.85120
30.40.65140
40.60.45160
50.80.25180
61.0051100
1.4蛋白酶活力計(jì)算
蛋白酶活力，Ax4xN/l0。
式中:A:對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的酪氨酸釋放量；4:4機(jī)反應(yīng)液取出1mL；N:酶粉的稀釋倍數(shù)；10:反應(yīng)時(shí)間1Omin；蛋白酶活性定義:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。
2淀粉酶活力的測(cè)定
測(cè)定淀粉酶活力的方法有4類(lèi)，一是測(cè)定底物淀粉的消耗量，有粘度法、濁度法和碘-淀粉比色法等；二為生糖法，測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖的生成量；三為色原底物分解法，四是酶偶聯(lián)法。其中碘-淀粉比色法測(cè)淀粉酶活力操作簡(jiǎn)便迅速、實(shí)用。
2.1原理
碘-淀粉比色法淀粉經(jīng)α-淀粉酶催化水解，生成產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物淀粉濃度已知且過(guò)量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與末被催化水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物。其藍(lán)色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較成比例，從而計(jì)算出淀粉的量，推算肘淀粉酶活力。
2.2試劑
2.21底物緩沖液
精確稱，取9.0g；氯化鈉；22。6g無(wú)水磷酸二鈉和12.5g無(wú)水磷酸二氫鉀，置于約500mL去離子水中力口熱至沸騰溶解。稱取0.4g可溶性淀粉于一小燒杯中，加入10mL去離子水，使其混懸后加人上述沸騰溶液中，冷卻至室溫后加入5mL37%甲醛溶液，用去離子水稀釋至1000mL。此即為pH7.0、酶底物淀粉濃度為0.4g/L的緩沖液。
2.2.2碘貯存液(0.1mol/L)
稱取1.7835g碘酸鉀和22.5g碘化鉀，溶于去離子水中，再緩慢加人4.5mL濃鹽酸，用去離子水稀釋至500mL，充分混勻，貯棕色瓶中，每月配制新鮮溶液，置冰箱中保存。
2.2.3碘稀釋液(0.lmol/L)取碘貯備液用去離子水稀釋10倍，貯棕色瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2.3操作步驟
稱取酶粉1.0g充分碾細(xì)，加去離子水100mL,在40℃水中攪拌30min，充分溶出酶蛋白，過(guò)濾，濾液備用。按表2分別加入底物緩沖液、酶濾液、碘稀釋液和去離子水，混勻，于660nm波長(zhǎng)處(lcm光徑)，以去離子水調(diào)吸光度為零，讀各管吸光度。
表2試劑用量
加入物測(cè)定管（Ｕ）（３支平行樣）空白管（Ｂ）
底物緩沖液(40℃預(yù)溫５min,mL)1.01.0
酶濾液（mL）混勻，40℃水浴7.5min0.2-
碘稀釋液（mL）1.01.0
去離子水（mL）6.06.2
2.4淀粉酶活力計(jì)算
淀粉酶活力=式中:AB:空白管吸光度；AU:測(cè)試管吸光度；淀粉酶活性定義:lmL酶濾液中(1g酶粉)的酶，在40℃和底物淀粉作用30min，水解10mg淀粉為1個(gè)淀粉酶活性單位。
3討論
目前市場(chǎng)上出售的酶制劑種類(lèi)很多，由于酶的定義和測(cè)定方法至今沒(méi)有統(tǒng)一，不同的生產(chǎn)廠家采用標(biāo)準(zhǔn)和定義往往各不相同，產(chǎn)品質(zhì)量說(shuō)明也就缺少科學(xué)依據(jù)。本文簡(jiǎn)介了蛋白酶和淀粉酶活性定義和測(cè)定方法，供同行共同探討，以便找出更加科學(xué)、合理、統(tǒng)一的簡(jiǎn)便易行的酶活測(cè)定方法，促進(jìn)酶制劑在飼料工業(yè)中的發(fā)展。
摘自：中國(guó)飼料添加劑網(wǎng)
